Spektrofotometrinen kolorimetrinen proteiinin kvantifiointi
Proteiinit ovat tavallisesti proteiinien seos. Kolorimetriset määritykset perustuvat proteiinin ainesosiin: Aminohapot (esim. Tyrosiini, seriini) reagoivat lisätyn kromogeenisen ryhmän tai värin kanssa värillisen materiaalin tuottamiseksi. Värjätyn aineen konsentraatio liittyy suoraan aminohappojen määrään, jonka proteiini reagoi, mikä heijastaa proteiinikonsentraatiota.
Kolorimetrinen menetelmä
On olemassa useita menetelmiä, kuten BCA, Bradford ja Lowry.
Lowry-menetelmä: perustuen aikaisempaan Biuret-reaktioon ja parannettu. Proteiini reagoi Cu2: n kanssa sinisen reaktion tuottamiseksi. Lowryn menetelmä on kuitenkin herkempi kuin Biuret. Haittapuolena on tarve lisätä useita eri reagensseja peräkkäin; reaktio kestää kauan; on altis ei-proteiinisille aineille; proteiineja, jotka sisältävät EDTA: ta, Triton x-100: tä ja ammoniumsulfaattia, eivät sovellu tähän menetelmään.
Bininkoniiniinihappomääritys: Tämä on uudempi, herkempi proteiinimääritys. Analysoitava proteiini reagoi Cu2: n kanssa emäksisessä liuoksessa Cu: n tuottamiseksi, joka muodostaa kelaatin BCA: lla muodostaen violettiyhdisteen, jonka absorptiopiikki on 562 nm. Tämän yhdisteen ja proteiinin pitoisuuden välinen lineaarinen suhde on voimakas ja reaktion jälkeen muodostunut yhdiste on erittäin stabiili. Lowryn menetelmän suhteen toiminta on yksinkertaista ja herkkyys on suuri. Kuitenkin, kuten Lowry-menetelmällä, se on altis häiritsemättä proteiineja ja pesuaineita.
Bradford-menetelmä: Tämän menetelmän periaate on, että proteiini reagoi Coomassie Brilliant Blue -värin kanssa muodostaen värillisen yhdisteen, joka absorboi 595 nm: ssä. Sen suurin piirre on sen herkkyys, joka on kaksi kertaa Lowryn ja BCA: n taso. Se on yksinkertaisempi ja nopeampi. Se vaatii vain yhdenlaista reaktioreagenssia. Yhdiste voi olla stabiili 1 tunti tuloksen helpottamiseksi; Lowryn kanssa häiritsevät BCA reagoi pelkistävien aineiden (esim. DTT, merkaptoetanoli) kanssa yhteensopivalla tavalla. Se on kuitenkin edelleen herkkä pesuaineille. Tärkein haittapuoli on se, että erilaiset standardit voivat johtaa suuria eroja saman näytteen tuloksissa eikä vertailukelpoisia tuloksia.
Jotkut tutkijat, jotka altistuvat kolorimetrisille mittauksille ensimmäistä kertaa, voivat sekoittaa eri kolorimetristen testien tulokset. Millaisia menetelmiä uskot olevasi sekava? Koska ryhmät reagoivat eri tavoin ja kromogeeniset ryhmät eivät ole samat, käytetään useita menetelmiä samanaikaisesti, jotta saman näytteen näytekonsentraatiot olisivat epäjohdonmukaisia. Esimerkiksi Keller et ai. testasi proteiinia äidinmaidossa ja havaitsi, että Lowryn ja BCA: n mitatut pitoisuudet olivat huomattavasti korkeammat kuin Bradfordin. Ero oli merkittävä. Vaikka sama näyte määritettäisiin, sama kolorimetrisellä menetelmällä valittu standardinäyttee on epäjohdonmukainen ja pitoisuus testin jälkeen on myös epäjohdonmukainen. Käytä esimerkiksi Lowryä proteiinin testaamiseen soluhomogenaatissa käyttäen standardia BSA: ta, jonka pitoisuus on 1,34 mg / ml ja globuliini standardina, jonka pitoisuus on 2,64 mg / ml. Siksi ennen kuin valitaan kolorimetrinen menetelmä, on suositeltavaa viitata testattavan näytteen kemialliseen koostumukseen ja löytää kemiallisesti samanlainen standardiproteiini standardina. Lisäksi kolorimetrinen menetelmä proteiinien määrittämiseksi aiheuttaa usein ongelmia siinä tapauksessa, että näytteen absorbanssiarvo on liian alhainen, mikä johtaa suurta eroa mitatun näytteen pitoisuuden ja todellisen pitoisuuden välillä. Keskeinen kysymys on, että 1011-spektrofotometrin tärkeän osan värillä, kyvetillä, on tietty puoliintumisaika, joten jokainen kolorimetrinen menetelmä paljastaa reaktion koeajan. Kaikki näytteet (mukaan lukien standardinäytteet) on testattava tänä aikana. Jos aika on liian pitkä, saadun absorbanssin arvo pienenee ja muuttunut pitoisuusarvo pienenee. Lisäksi reaktiolämpötila, liuoksen pH-arvo jne. Ovat kaikki tärkeitä tekijöitä, jotka vaikuttavat kokeeseen. Lisäksi on erittäin tärkeää käyttää muovinen kolorimetria. Vältä kvartsista tai lasista valmistettujen kyvettien käyttämistä, koska värin jälkeen reaktio aiheuttaa kvartsin tai lasin värjäämisen, mikä johtaa näytteen virheelliseen absorbanssiin.
Yritys on erikoistunut spektrofotometrien myyntiin, tervetulleita asiakkaita, jotka tarvitsevat konsultointia ja ostoa, tarjoamme sinulle vilpitöntä palvelua ja laatutuotteita sekä alhaisempia hintoja.
Sähköposti: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com