Spektrofotometreistä on tullut rutiininomaisia välineitä nykyaikaisissa molekyylibiologian laboratorioissa. Usein käytetään nukleiinihappoon, proteiinin kvantifiointiin ja bakteerikasvupitoisuuksien kvantifiointiin.
Yksinkertainen spektrofotometrin periaate
Spektrofotometri käyttää valonlähdettä, joka voi tuottaa useita aallonpituuksia, ja kulkee joukon spektroskooppisia laitteita tuottamaan tietyn aallonpituuden omaava valonlähde. Kun valonlähde läpäisee testattavan näytteen, osa valonlähteestä imeytyy ja näytteen absorbanssi lasketaan, jolloin se muuttuu näytteen pitoisuudeksi. . Näytteen absorbanssi on verrannollinen näytteen konsentraatioon.
Nukleiinihappojen kvantifiointi
Nukleiinihappojen kvantifiointi on spektrofotometrin yleisimmin käytetty toiminto. Oligonukleotidit, yksijuosteinen, kaksisäikeinen DNA ja RNA voidaan kvantifioida puskurissa. Nukleiinihapon korkeimman absorptiohuipun absorptiopiikki on 260 nm. Kunkin nukleiinihapon molekyylikoostumus on erilainen, joten muuntokertoimet ovat erilaisia. Eri tyyppisten nukleiinihappojen kvantifioimiseksi valitse vastaavat kertoimet etukäteen. Esimerkiksi 1 OD: n absorbanssi vastaa 50 μg / ml dsDNA: ta, 37 μg / ml ssDNA: ta, 40 μg / ml RNA: ta ja 30 μg / ml Oligia. Testin jälkeen absorbanssi muunnetaan edellä esitetyillä kertoimilla vastaavan näytekonsentraation saamiseksi. Valitse ennen testausta oikea menettely, kirjoita kantaliuoksen ja laimennusaineen tilavuus ja testaa sitten tyhjä ja näyteliuos. Kokeilu ei kuitenkaan aina ollut sileä. Epävakaat lukemat voivat olla kokeilijan suurin päänsärky. Suuremmalla herkkyydellä varustetut instrumentit osoittavat suurempaa absorptiota.
Itse asiassa spektrofotometrin suunnitteluperiaate ja toimintaperiaate mahdollistavat sen, että absorbanssi vaihtelee tietyllä alueella, ts. Instrumentilla on tietty tarkkuus ja tarkkuus. Esimerkiksi Eppendorf-biofotometrin tarkkuus on ≤1,0% (1A). Tällaisten useiden testien tulokset vaihtelevat välillä noin 1,0% keskiarvosta ja ovat normaaleja. Lisäksi on myös otettava huomioon itse nukleiinihapon fysikaalis-kemialliset ominaisuudet ja sen puskurin pH, jossa nukleiinihappo on liuennut, ionipitoisuus jne.: Kun ionikonsentraatio on liian korkea testin aikana, lukemisen muutokset, joten on suositeltavaa käyttää tiettyä pH-arvoa ja alhaista ionipitoisuutta. Puskurit, kuten TE, stabiloivat suuresti lukemat. Näytteen laimennuskonsentraatio on myös tekijä, jota ei voida jättää huomiotta: joidenkin hienojen hiukkasten, erityisesti nukleiinihapponäytteiden, väistämätön läsnäolo näytteessä. Näiden pienten hiukkasten läsnäolo häiritsee testituloksia. Hiukkasten vaikutuksen minimoimiseksi testituloksiin nukleiinihapon absorbanssin on oltava vähintään suurempi kuin 0,1 A, ja absorbanssi on edullisesti välillä 0,1 - 1,5 A. Tämän alueen sisällä on häiriö. hiukkaset ovat suhteellisen pieniä ja tulos on vakaa.
Tämä tarkoittaa, että näytteen pitoisuus ei saa olla liian alhainen tai liian korkea (fotometrin testialueen ulkopuolella). Lopuksi toimintakertoimien, kuten sekoittamisen, pitäisi olla riittäviä, muuten absorbanssiarvo on liian alhainen, jopa negatiiviset arvot; seosta ei voi esiintyä kuplia, tyhjällä nesteellä ei ole suspendoitunutta ainetta, muuten lukeminen haihtuu jyrkästi; sama kyvetti on käytettävä aihion ja näytteen testaamiseen. Muuten konsentraation ero on liian suuri; muuntokerroin ja näytepitoisuusyksikkö valitaan johdonmukaisesti; kyvettiä, jossa on ikkunan kulumista, ei voida käyttää; näytteen tilavuuden on saavutettava kyvetin edellyttämä vähimmäismäärä.
Nukleiinihappokonsentraation lisäksi spektrofotometrillä on myös useita erittäin tärkeitä suhteita, jotka osoittavat näytteen puhtauden, kuten A 260 / A 280 -suhteen, jota käytettiin näytteen puhtauden arvioimiseksi, koska proteiinin absorptiopiikki on 280 nm. Puhdas näyte, jonka suhde on suurempi kuin 1,8 (DNA) tai 2,0 (RNA). Jos suhde on pienempi kuin 1,8 tai 2,0, se osoittaa proteiinin tai fenolisten aineiden läsnäolon. A 230 osoittaa, että näytteessä on joitakin epäpuhtauksia, kuten hiilihydraatteja, peptidejä, fenoleja jne., Ja puhtaamman nukleiinihapon A 260 / A 230 suhde on suurempi kuin 2,0. A 320 havaitsee liuoksen sameuden ja muut häiriötekijät. Puhtaiden näytteiden tapauksessa A 320 on yleensä 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd.
Lisää: No.168 Wuchang Ave., Yuhangin piiri, Hangzhou 310023, Kiina
TEL: + 86-571-88739859
Puhelin: +8618658504900
Sähköposti: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com